水果中相當(dāng)部分的干物質(zhì)是有機(jī)酸,它往往比許多其他物質(zhì)更多地決定水果的特殊味道,并在食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)中占有重要位置，有機(jī)酸除了具有抗生素作用外，還具有其它幾種作用，包括降低消化物pH和增加胰腺分泌。不同種類的水果中有機(jī)酸的種類和含量差別很大,故在現(xiàn)代食品工業(yè)中對(duì)有機(jī)酸的研究已愈加重視和普及。液相色譜法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,可同時(shí)定量測(cè)定多種有機(jī)酸,但液相色譜法測(cè)定水果中有機(jī)酸的報(bào)道中有機(jī)酸種類及水果品種相差較多，尤其是草莓與油桃這兩類水果未見(jiàn)報(bào)道。
考慮到***體成分復(fù)雜,從保護(hù)色譜柱及提高分離效果的目的出發(fā),本文將卡瑞(Carrez)試劑作為水果樣品凈化劑應(yīng)用于水果中有機(jī)酸的測(cè)定.
1實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器與試劑
Agilent1100液相色譜儀(含四元泵、柱溫箱、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、定量環(huán)等).水相針式過(guò)濾頭,去離子水(電阻率可達(dá)18MΩ·cm).草酸、酒石酸、維生素C(抗壞血酸)、L2蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸(丁二酸)等有機(jī)酸對(duì)照品均為分析純?cè)噭?/span>.甲醇為色譜純?cè)噭?/span>,磷酸二氫鈉及磷酸為分析純?cè)噭?/span>.流動(dòng)相經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾.樣品為市售新鮮水晶梨、碭山梨、蘋果梨、新疆香梨、新疆貢梨、富士蘋果、草莓、油桃等
1.2對(duì)照品及供試品溶液的制備
對(duì)照品溶液的制備:分別稱取適量各有機(jī)酸對(duì)照品(0.5～1.5g,至0.1mg),分別用流動(dòng)相緩沖溶液溶解并定容于100mL容量瓶中,作為有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)貯備液.使用時(shí)各取1.00mL配制成有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)液,再將混合標(biāo)準(zhǔn)液在25mL容量瓶中用流動(dòng)相緩沖溶液稀釋成不同的濃度梯度,即上述溶液濃度的0.2,0.4,0.6,0.8,1.0倍。
供試品溶液的制備:榨汁法制樣(選果2削皮2切片2榨汁2過(guò)濾),所得果汁準(zhǔn)確稱取3g左右,加入適量流動(dòng)相緩沖溶液后,加入Carrez試劑I和II各0.1mL,再用流動(dòng)相緩沖溶液定容于25mL容量瓶中,靜置
1.3色譜條件
色譜柱:EclipseXDB2C8柱(4.6×150mm,5μm);流動(dòng)相A:甲醇,流動(dòng)相B:0.01mol·L-1磷酸二氫鈉2磷酸緩沖液(pH=2.6);梯度洗脫程序:0～2.4min內(nèi),由7.5%A變化為1.5%A,此后流動(dòng)相A的比例不變.流動(dòng)相流速:0.5mL·min-1;進(jìn)樣體積:20μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):214nm;柱溫:25°
2結(jié)果與討論
2.1色譜條件的優(yōu)化
2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定
對(duì)每種有機(jī)酸的吸光度進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,發(fā)現(xiàn)這8種有機(jī)酸的zui大吸收波長(zhǎng)在204～243nm之間.并經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定214nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
2.1.2流動(dòng)相的選擇及其pH值的確定
甲醇2水系統(tǒng)或甲醇2磷酸鹽緩沖系統(tǒng)是在C8或C18柱中應(yīng)用zui廣的流動(dòng)相,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用甲醇2磷酸鹽緩沖系統(tǒng)更適合使用C8柱分析有機(jī)酸.由于流動(dòng)相的pH值對(duì)有機(jī)酸的保留時(shí)間有較大影響,因此,通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值(pH2.3,2.5,2.6,2.7,2.8)對(duì)8種有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè),當(dāng)pH值較小時(shí)草酸與酒石酸分離效果很好,但富馬酸和琥珀酸分離效果不佳;當(dāng)pH值較大時(shí)結(jié)果相反.pH值為2.6時(shí)分離效果較好.
2.1.3流動(dòng)相流速
實(shí)驗(yàn)分別考察了0.2,0.5,0.8,1.0mL·min-14個(gè)條件.流速為0.5mL·min-1時(shí),色譜分離效果.
2.1.4流動(dòng)相的配比
分別考察了等度洗脫(甲醇含量分別為1%,2%,3%,5%,6%)及梯度洗脫兩種情況.發(fā)現(xiàn)在等度洗脫中,當(dāng)甲醇比例較大時(shí)草酸與酒石酸分離較好,但檸檬酸與乳酸、富馬酸和琥珀酸分離效果不佳;當(dāng)甲醇比例較小時(shí)分離情況相反.且每種甲醇比例均不能使維生素C與L2蘋果酸得到有效分離,說(shuō)明等度洗脫不能滿足分離要求.根據(jù)上述經(jīng)驗(yàn),經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)嘗試了各種梯度后,發(fā)現(xiàn)當(dāng)梯度為0～2.4min內(nèi),流動(dòng)相中甲醇的比例由7.5%變化為1.5%,此后流動(dòng)相A的比例不變時(shí),維生素C與L2蘋果酸分離較好并能夠進(jìn)行定量分析,其他有機(jī)酸也能達(dá)到分離的目的。
2.2線性關(guān)系、檢出限、精密度及回收率
將混合標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的系列工作溶液,按上述色譜條件依次由低濃度向高濃度經(jīng)0.45μm針頭過(guò)濾后進(jìn)樣20μL,采集數(shù)據(jù).分別以各組分的峰面積y對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度x(mg·mL-1)進(jìn)行線性回歸分析,8種有機(jī)酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表1。
準(zhǔn)確稱取相同樣品(水晶梨)兩份,其中1份加入已知量有機(jī)酸標(biāo)樣,另一份不加,每份樣品平行測(cè)定3次,利用增量法計(jì)算回收率,并計(jì)算變異系數(shù)。
由表1可知,有機(jī)酸回歸方程的相關(guān)系數(shù)大于0.9995,線性良好.本法的回收率在93.01%～101.79%之間,變異系數(shù)在4%以內(nèi),精密度較高,結(jié)果準(zhǔn)確。
2.3樣品制備方法的探討
2.3.1關(guān)于榨汁制樣法與水果中維生素C含量的測(cè)定
采用榨汁法測(cè)定水果中有機(jī)酸,未能檢測(cè)出水果中的維生C,故懷疑在樣品制備過(guò)程中,維生素C被破壞而未能檢測(cè)到.本實(shí)驗(yàn)也采用榨汁法制樣并檢測(cè)到了維生素C,且效果良好.比較本實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)制樣過(guò)程中有明顯不同的一點(diǎn)就是本實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)相酸性緩沖液定容,選用純水定容.這是由于液體維生素C具有較強(qiáng)的還原性,易受空氣、熱、光等因素影響,但在酸性溶液中較穩(wěn)定.故采用榨汁法制樣,用流動(dòng)相酸性緩沖液定容,從而實(shí)現(xiàn)了維生素C的檢測(cè)。
2.3.2樣品制備中加入Carrez試劑
液相色譜法對(duì)樣品的處理要求較高,一方面要求樣品成分盡量簡(jiǎn)單以消除基體對(duì)測(cè)定對(duì)象的干擾,另一方面對(duì)色譜柱的容量、使用壽命等保護(hù)色譜柱的角度要求進(jìn)柱之前的樣品盡量簡(jiǎn)單.而水果原汁樣品往往成分復(fù)雜,基體干擾大,對(duì)色譜柱負(fù)擔(dān)重.本實(shí)驗(yàn)從保護(hù)色譜柱及提高分離效果的目的出發(fā),嘗試向水果樣品中加入Carrez試劑,使蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)沉淀。
在含果汁3g左右,欲25mL定容的樣品中加Carrez試劑I和II各0.1mL與不加Carrez試劑的原樣進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入Carrez試劑I和II各0.1mL,色譜峰數(shù)及保留時(shí)間基本不變,其有機(jī)酸含量也基本保持不變,即Carrez試劑的加入不影響水果有機(jī)酸含量的測(cè)定.如果增加Carrez試劑的加入量(如加入0.25mL),則對(duì)樣品中有機(jī)酸的測(cè)量產(chǎn)生一定影響,使測(cè)量值普遍偏低(富馬酸除外)。
加入Carrez試劑的另一特點(diǎn)就是可以提高有機(jī)酸分析的精密度和回收率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.加入Car2rez試劑處理樣品后每種有機(jī)酸的測(cè)定精密度均有不同程度的提高,乳酸、檸檬酸、富馬酸的回收率也比不加Carrez試劑時(shí)有了明顯好轉(zhuǎn)。
2.4不同水果有機(jī)酸含量的分析結(jié)果
2.4.1不同梨品種中有機(jī)酸含量
按2.1和2.3中所述的*色譜檢測(cè)條件和制樣方法,分別測(cè)定水晶梨、碭山梨、蘋果梨、新疆香梨、新疆貢梨中的有機(jī)酸.不同品種梨中有機(jī)酸含量見(jiàn)表3。
由表3可知,不同品種梨中各種有機(jī)酸所占的比例基本相同.碭山梨草酸含量低(0.228),維生素C含量較高(0.546).水晶梨雖然草酸含量略高(0.307),但維生素C(0.450)、蘋果酸(1.651)、檸檬酸(1.027)含量較高.蘋果梨中蘋果酸(1.807)與檸檬酸(1.107)含量高,但相應(yīng)的維生素C含量較低(0.323),且草酸含量略高(0.391)。
2.4.2不同水果中有機(jī)酸含量
按2.1和2.3中所述的*檢測(cè)條件和制樣方法,分別測(cè)定草莓、水晶梨、富士蘋果、油桃水果中有機(jī)酸含量見(jiàn)表4。
由表4可知,草莓(0.592)和梨(0.450)中維生素C含量較高,蘋果(2.482)和油桃(3.400)中蘋果酸含量較高.油桃中有機(jī)酸種類zui為豐富,營(yíng)養(yǎng)全面,且草酸含量低(0.242).梨中維生素C含量高(0.450),草酸含量低(0.307),相對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值z(mì)ui高.草莓維生素C(0.592)及檸檬酸(7.505)含量*,但草酸含量也zui高(1.137),可作為提取維生素C及檸檬酸的原料。
實(shí)驗(yàn)建立了一種液相色譜測(cè)定水果中有機(jī)酸類物質(zhì)的方法.使用C8柱,甲醇2磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫,在6min內(nèi)較好地分離和定量分析了草莓、梨、蘋果及油桃等水果中8種有機(jī)酸的含量.使用Carrez試劑作為水果樣品凈化劑,不僅可達(dá)到凈化樣品、保護(hù)色譜柱的目的,同時(shí)可以適當(dāng)提高樣品檢測(cè)的精密度和回收率.該方法不僅準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好,而且分析效率高.為定量分析能夠榨成汁的水果中有機(jī)酸類物質(zhì)的含量提供了參考,對(duì)水果食品加工及保鮮有一定的實(shí)際意義.用該方法分析了不同品種梨中各有機(jī)酸的含量,結(jié)果顯示不同品種梨中各種有機(jī)酸所占的比例基本相同.幾種水果中油桃含有機(jī)酸種類zui為豐富,草莓中維生素C及檸檬酸含量*。
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